Né le 26 août 1977 à Kiev, alors en République socialiste soviétique d'Ukraine, Gene Stupnitsky déménage avec ses parents dans la banlieue de Chicago alors qu'il n'a que neuf mois. Diplômé de l'université de l'Iowa, il fonde avec son complice de toujours Lee Eisenberg la société de production Quantity Entertainment. Le duo intègre l'équipe de scénaristes de la sitcom The Office, sur laquelle Stupnitsky officie comme scénariste, réalisateur et producteur de 2005 à 2010, lui valant trois nominations aux Emmy Awards. Toujours avec Eisenberg, il écrit les scénarios des comédies L'An 1 : des débuts difficiles en 2009 et Bad Teacher en 2011, avant de cocréer pour HBO la série Hello Ladies en 2013. Il fait ses débuts de réalisateur en 2019 avec Good Boys, comédie initiatique portée par de jeunes acteurs comme Jacob Tremblay, coécrite avec Eisenberg et produite par Seth Rogen, qui rencontre un joli succès au box-office. Il retrouve la réalisation en 2023 avec Le Challenge, comédie avec Jennifer Lawrence, avant de cocréer avec Eisenberg la série Jury Duty, récompensée d'un Peabody Award.
Le cinéma de Gene Stupnitsky se caractérise par un humour cru et provocateur, hérité de son expérience de scénariste de sitcoms, qu'il applique aussi bien à la comédie initiatique adolescente qu'à la comédie romantique pour adultes.
Le scénariste et producteur Lee Eisenberg est son collaborateur le plus constant depuis leurs débuts communs sur The Office jusqu'à la série Jury Duty, en passant par l'ensemble de ses films en tant que réalisateur.